对化石燃料的需求逐渐增加，需要可再生的生物燃料替代品。这引起了越来越多的研究，以设计具有与化石燃料相当的物理化学和燃烧特性的创新能源燃料。用于生物能源合成的高效微生物希望熟练消耗大量碳底物，通过有效的代谢途径转移各种碳水化合物，能够承受抑制成分和其他降解化合物，并提高代谢通量以合成目标化合物。代谢工程微生物可能是通过谨慎操纵酶和代谢途径从纤维素生物质合成生物燃料的有效方法。印度喀拉拉邦阿姆里塔普里阿姆里塔普里生物技术学院Madhavan综述了应用各种异源宿主合成先进生物燃料的代谢和基因工程技术的趋势和进展。可能的技术包括酶工程、多个基因的异源表达、用于基因组编辑的 CRISPR-CAS 技术和细胞表面显示。
图文解读
木质纤维素生物质包括纤维素（50%），半纤维素（30%）和木质素（约15%），其余1%含有果胶，蜡和蛋白质。木质纤维素降解始于结盟酶（漆酶和过氧化物酶）的活性。纤维素降解由一系列酶催化。木聚糖和甘露聚糖是重要的半纤维素成分，在内切-4，1-β-木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、α-葡萄糖醛酸酶、对香豆酸酯酶、β-甘露糖苷酶、β-甘露聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、乙酰甘露聚糖酯酶和α-半乳糖苷酶等酶的作用下降解。这些酶在木质纤维素生物质的生物燃料制备中起着至关重要的作用。酶预处理比其他预处理方法更有效，因为产量相对较高。然而，所需的酶成本和条件有时使它们不适合工业目的。因此，作者不断努力开发成本更低、在工业条件下工作更好的酶和酶混合物。对于工业应用，总是需要具有更好稳定性、特异性和活性的酶，并且这些品质被整合在一起，通过使用基因工程来开发重组酶。纤维素分解和非纤维素分解生物都经过基因工程改造，用于增强木质纤维素生物质的生物燃料生产。木质纤维素降解和微生物利用如图1所示。
Fig.1. Lignocellulose hydrolysing enzymes and engineered sugar utilization pathways for the synthesis of biofuel in microbes.
微生物酶可以转化生物质。然而，这些酶对其工业应用有一些局限性。这些酶在工业条件下无法正常工作。为了克服这一点，酶被固定在基质或纳米材料中，以便在工业条件下获得更好的催化活性。在基因水平上操纵酶是使酶适合工业应用的最新方法。酶工程可以在不同水平上进行，以提高蛋白质活性，热稳定性，pH耐受性和蛋白酶抗性。本节介绍蛋白质工程方法（图2），以增强木质纤维素生物质转化的功能表达和细胞定位。
Fig. 2. Protein engineering approaches for functional expression and cellular localization of lignocellulolytic enzymes.
丁醇的全球市场由于其优于乙醇的性能而正在增长。与石化生产相比，生物丁醇由梭菌通过丙酮-丁醇-乙醇发酵以非竞争性、低滴度与乙醇和丙酮天然合成。为了提高丁醇产量滴度和速率，各种丁醇合成途径在大肠杆菌中异源表达，与梭状芽胞杆菌相比，易于遗传操作。用于生物燃料生产的代谢工程微生物列于表1中。
Table 1 metabolically engineered microbes for biofuel production.
用于生物燃料生产中木质纤维素生物质降解的转基因生物应符合其具有广泛底物特异性的标准，或者必须具有某种新的代谢途径，使生物质有效降解为生物燃料，或者必须耐受有毒的最终产物。代谢工程已成功增加底物的范围和特异性。引入新的代谢途径允许修饰的微生物利用更多的非葡萄糖碳底物。酿酒酵母中的磷酸戊糖途径工程和增强的木糖异构酶表达增加了木糖消耗并增强了乙醇产量。参与酿酒酵母l-阿拉伯糖途径的基因被密码子优化，以提高l-阿拉伯糖和乙醇生产的利用率。携带半乳糖代谢基因截短负调节因子的酿酒酵母乙醇产量增加。基因修饰允许确定底物特异性。Cho等人报道在乙酰丁基梭菌中引入adh基因，以便生物体选择丁酰辅酶A而不是乙酰辅酶A以产生更多的丁醇。表2总结了用于增强底物特异性、抑制剂和乙醇耐受性的各种方法。
Table 2 Various methods adopted for enhancing substrate specificity, inhibitor, and ethanol tolerance.
许多纤维素分解细菌可以通过称为纤维素体的有组织结构分解木质纤维素。这些蛋白质复合物包含一个非催化支架，该支架在粘连素和dockerin模块的支持下与几种亚基酶相互作用。纤维素体的结构允许组分酶接近，从而允许互补的生物催化活性，从而避免负反馈副产物积累并提供协同作用，从而提高生物质降解的效率。显示最大纤维素分解活性的所得菌株用于 Avicel 的乙醇发酵，并导致产生3 g/L 的。因此，酵母细胞表面显示在创建重组菌株方面发挥了重要作用，该菌株可以从木质纤维素底物中产生高乙醇滴度（表3）。
总结
确定新的和改进的生物催化剂和反应系统有望改善生物质的转化和利用。代谢工程技术的应用和进步有助于提高利用各种碳基质合成先进生物燃料的微生物产量。基于此，不断设计创新的生物合成途径，以制造具有与主流化石燃料极其可比或等于的物理化学性质和结构的新一代燃料。有信心的是，该领域的发现和进步将把许多廉价、丰富、环保的原料转化为创新的生物燃料，具有高产量、滴度、产量和商业水平的生产。
