背景介绍

根据世界卫生组织(WHO)的统计信息，肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因(约17.6%)，这归因于缺乏具体有效的检测手段。开发传感平台是目前癌症诊断和医学治疗领域的一个热点。醛及其衍生物可以反映强烈的氧化应激水平和肿瘤特异性组织组成和代谢，被认为是重要的生物指标。荧光光谱技术以其简便、快速、价格低廉、灵敏度高以及实时动态检测能力在有机物鉴定中得到了广泛的关注。在荧光传感方面，酰肼染料及其衍生物是一类具有很好荧光信号的多环芳香族化合物，该染料由酰肼基团(dye-NH)和荧光团组成，前者是检测醛的活性位点，后者具有良好的光稳定性。然而，这种荧光dye-NH不溶于水，在水介质传感系统面临巨大阻碍。乙基纤维素(EC)是一种具有生物相容性的两亲性聚合物，对于捕获荧光dye-NH和诱导水介质中形成胶束状聚合物纳米颗粒具有重要意义。

基于此，来自泰国朱拉隆功大学的Boosayarat Tomapatanaget团队通过在聚合纳米粒子中制备化学传感器的策略开发了一种新型胶束纳米探针，用于水介质中长链醛类化合物的荧光检测。胶束螺旋酰肼染料包覆乙基纤维素(EC@dye-NH)纳米传感器最初被认为是松散的胶束状纳米颗粒，它们提供微弱的荧光信号。然而，传感器的固有酰肼基团能够与醛基反应形成亚胺，这提供了与烷基长链醛疏水相互作用的驱动力，从而诱导EC@dye-NH纳米传感器的自组装封装和强荧光响应。作为概念验证，本研究所制备的传感平台对长链醛(特别是壬醛)显示出高选择性和高灵敏度。与壬醛结合后，酰肼染料封装提供了比短链和其他烷基链醛更强的荧光增强。因此，EC@dye-NH对肺液样品中的壬醛具有高亲和力和高选择性检测能力。

图文解读

通过FT-IR光谱对EC@dye-NH纳米材料的结构、化学性质和组成进行了表征。如Figure 1a所示，EC粉末的吸收光谱在3460、2972-2867和1050 cm-1附近有明显的峰，分别对应于纤维素的羟基(O-H)、?CH2基团和乙氧基的C?O?C拉伸振动。对于dye-NH, FT-IR光谱在3340 cm-1处的峰为肼基的脂肪族一级N-H拉伸，在1700 cm-1左右的尖峰归因于酰胺基团的羰基。从EC@dye-NH纳米材料的FT-IR光谱中可以明显观察到EC与dye-NH的混合特征峰，这证明了dye-NH能够通过包覆过程物理吸附在EC骨架上。Figure 1b(1,2)显示聚合物纳米传感器的形貌为均匀的球形纳米粒子，平均粒径范围为181.94±32.92 nm。特别地，从TEM图像可以观察到EC@dye-NH纳米颗粒的纳米囊状形状，且螺旋酰肼染料以胶束状聚合物纳米颗粒的形式分散在聚合物主链上。此外，EDX图显示了C、N和O元素随EC@dye-NH纳米颗粒分布在每个区域的数量百分比(Figure 1c)。令人惊讶的是，在EC@dye-NH纳米颗粒的核心位置，dye-NH的氮元素数量(4.41~4.87%)比在颗粒边缘的数量(2.73%)多约2倍，这表明dye-NH被包裹在EC骨架中，并完整地存在于EC@dye-NH纳米颗粒的疏水核中。

Figure 1. (a) FT-IR spectra of ethyl cellulose (EC, green), dye-NH (blue), and EC@dye-NH nanosensors (red). (b) SEM (left) and TEM (right) micrographs of EC@dye-NH nanosensors in the absence (1,2) and presence (3,4) of 250 μM nonanal. (c) EDX and STEM-EDX images of EC@dye-NH nanoparticles in aqueous solution.

溶液的pH值是影响荧光法长链醛检测灵敏度的主要因素之一。如Figure 2a,b所示，在酸性条件下，纳米传感平台与壬醛相互作用的荧光增强非常明显。然而，尽管EC@dye-NH纳米传感器对pH值为3.0的壬醛表现出最高的荧光响应，但强酸可能会使生物基质变性。因此，本研究使用pH为5.0的醋酸盐缓冲液体系。此外，反应时间也是传感平台的一个重要因素。从Figure 2c中可以看出，加入壬醛后，EC@dye-NH纳米传感器随反应时间的变化呈现出逐渐增强的荧光，并伴随红移发射带，说明该传感平台具有随时间变化的荧光响应。归一化荧光光谱(Figure 2d)显示，反应时间为15 min时，在515 nm附近出现了第一个完整宽带和轻微荧光红移的最佳点，可能在与壬醛相互作用时EC@dye-NH实现了完全包覆。本研究选择EC@dye-NH纳米传感器检测长链醛的最佳反应时间为15 min。进一步采用DLS测试来评估不同持续反应时间下的流体动力学尺寸(Figure 2e)，可以发现EC@dye-NH纳米传感器的均匀粒径有逐渐减小的趋势，在15~20 min左右达到最小，这与荧光增强一致。另一方面，随着反应时间的延长，EC@dye-NH纳米传感器与壬醛反应形成自组装包覆，其粒径逐渐增大。此外，水介质包围的纳米颗粒边界层表面的zeta电位值呈现明显负值，说明醋酸盐缓冲剂能够吸附在聚合物纳米颗粒的外表面(Figure 2f)。

Figure 2. (a) Fluorescence spectra and (b) plots of the fluorescent signals at 536 nm of EC@dye-NH nanosensors in the absence and presence of nonanal as a function of various pH in different buffer solutions. (c) Fluorescence spectra, (d) normalized fluorescence spectra, (e) the trend of hydrodynamic size (Dh), and (f) zeta potential measurement of EC@dye-NH nanosensors in the presence of nonanal under the reaction time range of 0-120 min.

确认了氨基功能化荧光染料和EC聚合物的重要传感作用后，对EC@dye-NH纳米传感器平台的选择性进行了研究。如Figure 3a所示，当EC和dye-NH的比例为1:1时，纳米传感平台对壬醛、辛醛、庚醛和己醛的长链醛检测具有显著的荧光强度变化，而没有其他客体分子的荧光响应，这些结果促使本研究选择1:1比例的EC和dye-NH来构建EC@dye-NH纳米传感器。为了满足肉眼检测的要求，对使用EC@dye-NH纳米传感器通过发光可视化检测长链醛进行了研究。如Figure 3b所示，在庚烷、辛烷和壬烷存在的情况下，EC@dye-NH纳米传感器在365 nm UV灯下的荧光亮度发生了显著变化，说明这种视觉检测与荧光方式完全一致。Figure 3c显示了在无客体(粉色线)和庚醛、辛醛和壬醛(分别为黄色、绿色和蓝色线)存在的情况下EC@dye-NH的荧光衰减曲线。其中，EC@dye-NH的荧光寿命为0.376 ns，而庚醛、辛醛和壬醛化合物的寿命分别为15.19、15.70和14.75 ns。从这个结果可以看出，EC@dye-NH的寿命较短是由于存在猝灭荧光的胺基造成的，EC@dye-NH和醛之间的反应抑制了胺基团，从而获得了更长的荧光寿命和量子产率。

Figure 3. (a) Fluorescence spectra and the enhancement of relative fluorescence intensity (F?F0) of EC@dye-NH. (b) Visual fluorescence of EC@dye-NH nanosensors upon the addition of various aldehyde species. (c) Fluorescence decay profiles of EC@dye-NH with 250 μM of long-chain aldehyde in buffer solution.

为了检验胶束EC@dye-NH纳米传感器对癌细胞中长链醛检测的传感亲和力，以EC@dye-O纳米颗粒作为阴性对照进行比较。从Figure 6a的荧光图像中可以看出，加入壬醛后A549/EC@dye-NH/壬醛(第3行)的绿色荧光发射强度明显变化，比加入壬醛前(第2行)的绿色荧光发射强度至少大3倍。这一结果表明该纳米传感平台通过荧光发射成功检测细胞环境中的长链醛，具有显著性(P < 0.0001，Figure 6b)。相比之下，引入壬醛后，A549/EC@dye-O体系的绿色荧光强度变化没有显著增强(n.s，Figure 6b)。基于这些结果，胶束EC@dye-NH纳米传感器可作为生物传感和医学领域的潜在荧光探针，应用于基于长链醛的高选择性和灵敏检测的肺癌疾病诊断。

Figure 6. (a) Differential interference contrast (DIC) and confocal fluorescence images and (b) quantitative analysis of the average fluorescence intensity of ratio RGB channels (Green/Blue) of A549 lung cancer cells before and after incubation with EC@dye-NH and EC@dye-O (15%v/v) nanosensors.

总结

综上所述，本研究成功开发了新型高效聚合物纳米颗粒作为荧光探针，用于水介质中长链醛的荧光光谱检测。本文中，荧光EC@dye-NH纳米传感器还实现了长链醛类识别策略的概念验证，具有较高的灵敏度和选择性。其中，在引入长链醛后，EC@dye-NH以其疏水特性作为动力，易于穿透胶束纳米粒子的内核，并通过形成亚胺与肼基官能团染料发生共价反应，将长链醛与其他有机化合物区分开。这些内在相互作用同时诱导了高度完整的自组装封装，促进了强荧光增强。此外，在pH=5.0的环境温度下快速反应15 min后，EC@dye-NH纳米传感器的荧光响应随长链醛浓度的增加而成比例增加。更重要的是，加入壬醛后，这些纳米传感器在人腺癌肺细胞中表现出显著的细胞内吸收并发射绿色荧光，可用于细胞成像，也为生物传感和成像提供了新的前景。