生物乙醇是最有前景的可持续可再生资源之一，其大规模生产有可能解决当前世界的环境和能源挑战。稳定的纤维素酶在生物乙醇发酵中起着关键作用，然而生产过程中逐渐增加的乙醇浓度会抑制酶的活性，甚至导致酶失活，从而严重制约乙醇产量的进一步提高。

蛋白质工程能够定向改造各种酶，以满足不同的工业应用需求。近日，南京师范大学黄和教授LICME课题组，以内切葡聚糖酶Cel5A（PvCel5A）作为研究模型，借助InSiReP 2.0策略 (In Silico guided Recombination Process)成功进化出高鲁棒性的PvCel5A突变体，并实现了乙醇产量的大幅度提高。

在InSiReP 2.0的前两个阶段 (图1)，研究人员以乙醇耐受性为筛选条件，结合Casting epPCR和20c-Tang技术最终确定了12有益单点突变。在第三阶段，应用CompassR策略，通过计算ΔΔGfold指导重组过程，得到了多个乙醇耐受型PvCel5A变体。同时发现这些变体对发酵抑制剂和高温具有耐受性，有优秀的工业应用潜力。

通过分子动力学模拟的综合计算研究，发现局部微调的灵活性和底物结合位点的溶解作用共同增强了PvCel5A变体的乙醇耐受性和热稳定性。最终，研究人员进一步将PvCel5A变体应用在以玉米为原料的一代乙醇和以秸秆为原料的二代乙醇中（图2）。结果发现，添加PvCel5A变体可使乙醇产量增加5.69%-10.08%。

该项研究证明了以工业实际生产状况为筛选标准，结合计算机辅助的蛋白质工程策略（如InSiReP 2.0），可使更多的酶能更好得被应用于生物转化、生物催化和生物医学领域。

图1: InSiReP 2.0的工作流程概述

图2: PvCel5A变体在乙醇生产应用流程及最终乙醇浓度及产率